考研笔记,第5期第1课5组王玉娟

  氨基酸和蛋白质

一、蛋白质的分类

    蛋白质的结构与功能


核心提示:1. 氨基酸(amino acid):是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物,氨基一般连在α-碳上。是蛋白质的构件分子。

  一、组成蛋白质的20种氨基酸的分类

蛋白质的种类繁多、结构复杂、功能各异。目前,蛋白质的分类主要是根据蛋白质的形状、组成和溶解性来进行。

    蛋白质的分子组成

  1. 必需1. 氨基酸(amino acid):是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物,氨基一般连在α-碳上。是蛋白质的构件分子。
  2. 必需氨基酸(essential amino acid):指人自己不能合成,需要从食物中获得的氨基酸。 3. 非必需氨基酸(nonessential amino acid):指人自己能由简单的前体合成,不需要从食物中获得的氨基酸。 4. 等电点(pI,isoelectric point):使分子处于兼性分子状态,在电场中不迁移的pH值。 5. 茚三酮反应(ninhydrin reaction):在加热条件下,氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色(与脯氨酸反应生成黄色)化合物的反应。6. 肽键(peptide bond):一个氨基酸的羧基与另一个的氨基的氨基缩合,除去一分子水形成的酰氨键。7. 肽:两个或两个以上氨基通过肽键共价连接形成的聚合物。 8. 蛋白质:是由多种普通氨基酸通过肽键彼此联接的具有一定空间结构的分子量一般在一万以上的生物大分子。9. 蛋白质一级结构(primary structure):指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。 10. 层析(chromatography):按照在移动相和固定相 之间的分配比例将混合成分分开的技术。 11. 离子交换层析(ion-exchange column):使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱 12. 透析:通过小分子经过半透膜扩散到水的原理,将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
  3. 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography):也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
  4. 亲合层析(affinity chromatograph):利用共价连接有特异配体的层析介质,分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其它分子的层析技术。15. 高压液相层析:使用颗粒极细的介质,在高压下分离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。
  5. 凝胶电泳(gel electrophoresis):以凝胶为介质,在电场作用下分离蛋白质或核酸的分离纯化技术。17. SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳:在去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。SDS-PAGE只是按照分子的大小,而不是根据分子所带的电荷大小分离的。18. 等电聚胶电泳:利用一种特殊的缓冲液在聚丙烯酰氨凝胶制造一个pH梯度,电泳时,每种蛋白质迁移到它的等电点处,即梯度足的某一pH时,就不再带有净的正或负电荷了。
  6. 双向电泳(two-dimensional electrophorese):等电聚胶电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚胶电泳分离,然后再进行SDS-PAGE。经染色得到的电泳图是二维分布的蛋白质图。
  7. Edman降解(Edman degradation):从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰,然后从多肽链上切下修饰的残基,再经层析鉴定,余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。
  8. 同源蛋白质(homologous protein):来自不同种类生物的序列和功能类似的蛋白质,例如血红蛋白

  1、非极性氨基酸

1.球状蛋白质和纤维状蛋白质

    蛋白质不仅是生物体的重要结构物质(结缔组织和骨的基质,形成组织形态),而且承担着各种生物学功能(催化反应,免广疫反应,血液凝固,物质代谢调控,基因表达,肌肉收缩等),还可做为能源物质供能(次要作用)。    蛋白质的元素组成主要是碳,氢,氧,氮,硫。其中氮的含量约为16%,因蛋白质是体内主要的含氮物,所以测定了生物样品含氮量就可以推算出样品的蛋白质含量。

  组成人体的蛋白质的原料:20+1种氨基酸(以肽键,二硫键(两个半胱氨酸间)相联),当然体内也有不参与合成蛋白质的氨基酸,但它们具有重要的生理作用(合成尿素的鸟,瓜,精氨酸代琥珀酸)

    *氨基酸通式:氨基,羧基,碳,结构各异的侧链*

    *氨基酸有两性解离的性质:等电点*

  20种氨基酸根据侧链和理化性质分为5类:非极性脂肪族,极性中性,芳香族,酸性,碱性氨基酸

  氨基酸--寡肽(I0个以下氨基酸残基)--多肽(50个以下)--蛋白质(多于了50)


          蛋白质的分子结构

    一级结构+高级结构或空间构象(二级,三级,四级)

    *只有2条及以上肽链的蛋白质才有四级结构*

    一级结构是从N端(氨基)到C端(羧基)的氨基酸(肽键,二硫键连接)排到顺序。

    *一级结构是空间构象基础

    *一级结构相似具有相似的高级结构与功能

    *氨基酸序列提供重要的生物进化信息

    *重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病,如分子病镰状红细胞贫血

    二级结构是主链原子的空间位置:螺旋,折叠,转角,无规卷曲,氨基酸残基侧链影响二级结构形成。

    三级结构的形成和稳定主要依靠疏水键,盐键,氢键,范德华力

    四级结构中亚基间以氢键和离子键结合

    *蛋白质空间结构破坏可引起变性


          氨基酸代谢即蛋白质代谢

    体内蛋白质代谢可用氮平衡描述

    氮平衡:总平衡(健康成人),正平衡(儿童,孕妇,恢复期病人),负平衡(肌饿,疾病)

    *营养学会推荐成人每日蛋白质需要量:男65克,女55克

    人体内有8种氨基酸不能合成,必须由食物提供(假(甲硫)设(色)来(赖)写(缬)一(异亮)两(亮)本(苯丙)书(苏))

    食物蛋白质营养价值的高低取决于其中必须氨基酸的种类和比例,种类和比例接近人体的营养价值高。

    *动物蛋白营养价值高

    *营养价值低的蛋白质混合食用可提高营养价值,即食物蛋白质互补作用


        蛋白质消化吸收腐败           

    食物中蛋白质…(胃)…多肽+氨基酸…(小肠)…寡肽+氨基酸…(小肠黏膜细胞膜载体蛋白)…细胞

    食物中未被消化的蛋白质和未被吸收的氨基酸在大肠被大肠杆菌分解腐败,产生一些有益的维生素和脂肪酸及更多的有害物质如胺(脱羧基),氨(脱氨基),酚,吲哚,硫化氢,其中大部分有害物随粪便排出,少部分被吸收经肝脏解毒(肝脏病人应低蛋白饮食)

  包括:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸

根据分子形状,将蛋白质分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。

  2、极性氨基酸

球状蛋白质分子比较对称,接近球形或椭球形,这类蛋白质中的疏水性基团倾向埋在蛋白质分子的内部,而亲水性基团倾向暴露在蛋白质分子的表面,所以,这类蛋白在水中较易溶解。烹饪原料中的许多蛋白质属于球蛋白,如大豆球蛋白、小麦球蛋白、菜子球蛋白、肌红蛋白、血红蛋白、乳清蛋白等。

  极性中性氨基酸:色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸

纤维状蛋白质,类似于细棒状或纤维状,溶解性质各不相同,大多数不溶于水,如胶原蛋白、角蛋白等,也有些溶于水,如骨骼肌中的肌球蛋白和肌动蛋白及血纤维蛋白原等。

  酸性氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸

2.简单蛋白质和结合蛋白质

  碱性氨基酸:赖氨酸、精氨酸、组氨酸

根据化学组成,将蛋白质分为简单蛋白质和结合蛋白质两类。

  其中:属于芳香族氨基酸的是:色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸

简单蛋白质分子中只含有氨基酸,没有其他成分。它又可根据理化性质及来源分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。

  属于亚氨基酸的是:脯氨酸

结合蛋白质是由蛋白质部分和非蛋白质部分结合而成,主要的结合蛋白有核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、金属蛋白、磷蛋白等。

  含硫氨基酸包括:半胱氨酸、蛋氨酸

3.可溶性蛋白醇溶性蛋白和不溶性蛋白

  注意:在识记时可以只记第一个字,如碱性氨基酸包括:赖精组

根据溶解度不同,将蛋白质分为可溶性蛋白、醇溶性蛋白和不溶性蛋白三类。

  二、氨基酸的理化性质

可溶性蛋白,可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱溶液。如精蛋白、清蛋白。

  1、两性解离及等电点:

醇溶性蛋白,不溶于水和稀盐溶液,溶于70%~80%的乙醇中,如玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白。

  氨基酸分子中有游离的氨基和游离的羧基,能与酸或碱类物质结合成盐,故它是一种两性电解质。在某一PH的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,成为兼性离子,呈电中性,此时溶液的PH称为该氨基酸的等电点。

不溶性蛋白,不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液和有机溶剂,如角蛋白、纤维蛋白。

  2、氨基酸的紫外吸收性质:

4.完全蛋白质、半完全蛋白质和不完全蛋白质

  芳香族氨基酸在280nm波长附近有最大的紫外吸收峰,由于大多数蛋白质含有这些氨基酸残基,氨基酸残基数与蛋白质含量成正比,故通过对280nm波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。

根据所含氨基酸的种类和数量不同,将蛋白质分为完全蛋白质、半完全蛋白质和不完全蛋白质三类。

  3、茚三酮反应

完全蛋白质是一类优质蛋白质。它们所含的必需氨基酸种类齐全,数量充足,比例适当。这一类蛋白质不但可以维持人体健康,还可以促进生长发育。奶、蛋、鱼、肉、大豆及其大豆制品中的蛋白质都属于完全蛋白质。

  氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物,此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比,因此可作为氨基酸定量分析方法。

半完全蛋白质所含氨基酸虽然种类齐全,但其中某些氨基酸的数量不能满足人体的需要。它们可以维持生命,但不能促进生长发育。例如,小麦中的麦醇溶蛋白便是半完全蛋白质,含赖氨酸很少。

  三、肽

不完全蛋白质不能提供人体所需的全部必需氨基酸,单纯靠它们既不能促进生长发育,也不能维持生命。例如,玉米胶蛋白、动物结缔组织和肉皮中的胶原蛋白皆是不完全蛋白质。二、蛋白质的结构

  两分子氨基酸可借一分子所含的氨基与另一分子所带的羧基脱去1分子水缩合成最简单的二肽。二肽中游离的氨基和羧基继续借脱水作用缩合连成多肽。10个以内氨基酸连接而成多肽称为寡肽;39个氨基酸残基组成的促肾上腺皮质激素称为多肽;51个氨基酸残基组成的胰岛素归为蛋白质。多肽连中的自由氨基末端称为N端,自由羧基末端称为C端,命名从N端指向C端。人体内存在许多具有生物活性的肽,重要的有:

蛋白质是由多种氨基酸结合而成的长链状多肽高分子化合物,每一种蛋白质构成氨基酸的种类、数目和顺序都是一定的。

  谷胱甘肽(GSH):是由谷、半胱和甘氨酸组成的三肽。半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。GSH的巯基具有还原性,可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中巯基免被氧化,使蛋白质或酶处于活性状态。

一个氨基酸的α-氨基与另一个氨基酸的α-羧基缩合失去一分子水,形成的化学键称为肽键。由肽键连接形成的化合物称为肽。各种氨基酸在蛋白质分子中以肽键相结合,由两个氨基酸组成的肽称为二肽,同样则有三肽、四肽以至多肽。由许多的氨基酸通过肽键相互连接而成的线状大分子,像链一样,被称为肽链。

  四、蛋白质的分子结构

蛋白质分子结构非常复杂,可分为一级结构和空间结构。蛋白质空间结构,又可分为二级结构、三级结构、四级结构。

  1、蛋白质的一级结构:即蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。

蛋白质的一级结构,即蛋白质的基本结构,是指蛋白质中各种氨基酸按一定顺序排列构成的蛋白质肽链骨架。维持蛋白质一级结构的作用力是肽键和二硫键。由于肽键和二硫键的作用力比较强,所以蛋白质的一级结构非常稳定,不易被破坏。

  主要化学键:肽键,有些蛋白质还包含二硫键。

蛋白质分子局部区域内,多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式,称为蛋白质的二级结构。以二级结构为其立体结构的蛋白质主要是一些纤维状蛋白质,如角蛋白、胶原蛋白、丝心蛋白等,存在于毛发、指甲、皮肤和筋腱中。在蛋白质的二级结构基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的空间构象为三级结构。由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定构象的蛋白质分子被称为蛋白质的四级结构,其中的每一条多肽链称为亚基。三、四级结构属于较高层次的蛋白质空间结构,具备三级结构的蛋白质分子,都有近似球状或椭球状的外形,所以,我们常把具有三级、四级结构的蛋白质称为球蛋白,与生命活动相关的重要蛋白质都是球蛋白,如酶、蛋白激素、运载和贮存蛋白、抗体蛋白等。烹饪原料中的许多蛋白质也是球蛋白,如大豆球蛋白、花生球蛋白、乳球蛋白等。

  2、蛋白质的高级结构:包括二级、三级、四级结构。

蛋白质的一级结构是形成蛋白质主干的基础,而决定其生物化学性质的,则是分布在主干内外表层上的各种化学基团的三维空间相对位置。蛋白质空间结构的维持力主要是氢键、静电引力、疏水作用等作用力较弱的次级键,另外也有二硫键、肽键等共价键。从维持空间结构的各种力来看,除共价键外都是较弱的。因此,环境的变化对这些力的影响非常明显,如温度、水中的电解质和pH的变化等,都会改变维持蛋白质空间结构的力,从而导致蛋白质分子空间结构的改变,所以说蛋白质很容易发生变化。第三节 蛋白质的性质

  1)蛋白质的二级结构:指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,也就是该段肽链骨架原子的相对空间位置,并不涉及氨基酸残基侧链的构象。二级结构以一级结构为基础,多为短距离效应。可分为:

一、 两性解离和等电点

  α-螺旋:多肽链主链围绕中心轴呈有规律地螺旋式上升,顺时钟走向,即右手螺旋,每隔3.6个氨基酸残基上升一圈,螺距为0.540nm。α-螺旋的每个肽键的N-H和第四个肽键的羧基氧形成氢键,氢键的方向与螺旋长轴基本平形。

组成蛋白质的氨基酸分子中含有氨基和羧基,它既能像酸一样解离,也能像碱一样解离,因此它具有两性性质,同样由氨基酸组成的蛋白质也具有两性性质,当蛋白质在某一pH时,其解离为阴离子和阳离子的趋势相等,蛋白质所带净电荷为零,此时的这一pH称为该蛋白质的等电点。

  β-折叠:多肽链充分伸展,各肽键平面折叠成锯齿状结构,侧链R基团交错位于锯齿状结构上下方;它们之间靠链间肽键羧基上的氧和亚氨基上的氢形成氢键维系构象稳定。

在等电点处,蛋白质颗粒间不存在静电相互斥力,因此,在等电点处,蛋白质的许多物理性质,如黏度、溶解度、水化程度等也都降到最低。

  β-转角:常发生于肽链进行180度回折时的转角上,常有4个氨基酸残基组成,第二个残基常为脯氨酸。

二、胶体性质

  无规卷曲:无确定规律性的那段肽链。

蛋白质是高分子化合物,由于相对分子质量大,它在水溶液中形成胶体溶液,所以蛋白质溶液具有胶体溶液的许多特征。如蛋白质溶液有扩散现象、沉降现象、电泳现象、电渗现象,不能通过半透膜并具有吸附性等。蛋白质之所以能以稳定的胶体存在主要是由于:

  主要化学键:氢键。

蛋白质分子大小已达到胶体质点范围(颗粒直径在1~100nm),具有较大表面积

  2)蛋白质的三级结构:指整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置,显示为长距离效应。

蛋白质分子表面有许多极性基团,这些基团与水有高度亲和性,很容易吸附水分子

  主要化学键:疏水键(最主要)、盐键、二硫键、氢键、范德华力。

实验证明,每1g蛋白质可结合0.3~0.5g的水,从而使蛋白质颗粒外面形成一层水膜。由于这层水膜的存在,使得蛋白质颗粒彼此不能靠近,增加了蛋白质溶液的稳定性,阻碍了蛋白质胶体从溶液中聚集、沉淀出来。

  3)蛋白质的四级结构:对蛋白质分子的二、三级结构而言,只涉及一条多肽链卷曲而成的蛋白质。在体内有许多蛋白质分子含有二条或多条肽链,每一条多肽链都有其完整的三级结构,称为蛋白质的亚基,亚基与亚基之间呈特定的三维空间排布,并以非共价键相连接。这种蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用,为四级结构。由一条肽链形成的蛋白质没有四级结构。

蛋白质分子在非等电状态时带有同性电荷 即在酸性溶液中带有正电荷,在碱性溶液中带有负电荷。由于同性电荷互相排斥,所以使蛋白质颗粒互相排斥,不会聚集沉淀。

  主要化学键:疏水键、氢键、离子键

如果这些稳定因素被破坏,蛋白质的胶体性质就会被破坏,从而产生沉淀作用。

  五、蛋白质结构与功能关系

三、沉淀作用

  1、蛋白质一级结构是空间构象和特定生物学功能的基础。一级结构相似的多肽或蛋白质,其空间构象以及功能也相似。尿素或盐酸胍可破坏次级键。β-巯基乙醇可破坏二硫键

蛋白质的沉淀作用是指在蛋白质溶液中加入适当试剂,破坏了蛋白质的水化膜或中和了其分子表面的电荷,从而使蛋白质胶体溶液变得不稳定而发生沉淀的现象。

  2、蛋白质空间结构是蛋白质特有性质和功能的结构基础。

在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐(如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。盐析可使蛋白质沉淀,这是由于这些盐类离子与水的亲和性大,又是强电解质,可与蛋白质争夺水分子,破坏蛋白质颗粒表面的水膜。另外,大量中和蛋白质颗粒上的电荷,使蛋白质成为既不含水膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。

  肌红蛋白:只有三级结构的单链蛋白质,易与氧气结合,氧解离曲线呈直角双曲线。

豆腐制作利用的就是蛋白质的盐析作用。在豆浆中加入氯化镁或硫酸钙(盐卤或石膏的主要成分),豆浆在70℃以上即可凝固。腌制咸鸭蛋也是典型的例子,盐对蛋白和蛋黄所表现的作用并不相同,食盐可使蛋白的黏度逐渐降低而变稀,却使蛋黄的黏度逐渐增加而变稠凝固,使蛋黄中的脂肪逐渐集聚在蛋的中心从而使蛋黄出油。

  血红蛋白:具有4个亚基组成的四级结构,可结合4分子氧。成人由两条α-肽链(141个氨基酸残基)和两条β-肽链(146个氨基酸残基)组成。在氧分压较低时,与氧气结合较难,氧解离曲线呈S状曲线。因为:第一个亚基与氧气结合以后,促进第二及第三个亚基与氧气的结合,当前三个亚基与氧气结合后,又大大促进第四个亚基与氧气结合,称正协同效应。结合氧后由紧张态变为松弛态。

与盐析作用相反,当在蛋白质溶液中加入中性盐的浓度较低时,蛋白质溶解度会增加,这种现象称为盐溶,这是由于蛋白质颗粒上吸附某种无机盐离子后,使蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥,并且蛋白质与水分子的作用却加强,从而促进蛋白质的溶解和水化。在肉制品加工中,为了提高制品的嫩度和鲜度,往往需要肌肉蛋白质发生盐溶,所以,肉制品加工前常用盐进行腌渍处理。

  六、蛋白质的理化性质

四、变性作用

  1、蛋白质的两性电离:蛋白质两端的氨基和羧基及侧链中的某些基团,在一定的溶液PH条件下可解离成带负电荷或正电荷的基团。

天然蛋白质分子因受物理或化学的因素影响,使蛋白质的理化性质和生物学性质有所改变,但并不导致蛋白质一级结构的破坏,这种现象称变性作用。蛋白质变性后的最显著变化是蛋白质的溶解度降低,变性严重时甚至互相团聚发生凝结而形成不可逆凝胶。烹饪过程中发生的沉淀、胶凝、凝集和凝固、黏度增大、膨胀性减小、热缩等现象,都与蛋白质变性有关。

  2、蛋白质的沉淀:在适当条件下,蛋白质从溶液中析出的现象。包括:

能使蛋白质变性的因素很多,如加热、酸、碱、盐、紫外线、有机溶剂、高压、剧烈的振荡和搅拌、研磨、微波处理等,其中加热是导致蛋白质变性最常用的手段。通常蛋白质变性温度在40~50℃以上,以后温度每升高10℃,蛋白质变性的化学反应速度就会大大加快,甚至提高近600倍。所以温度越高,蛋白质变性所需的时间越短。不同的烹调方法,蛋白质变性所需的温度和时间是不同的。在较低温度下炖煮肉类往往需要较长的时间,而在高温下的炸、爆、炒、煎仅需要几分钟的时间。鲜活水产品的醉腌所利用的就是酒精能使蛋白质变性这一原理,通过酒浸醉死,不用加热即可食用,如醉蟹、醉虾等。知识拓展

  a。丙酮沉淀,破坏水化层。也可用乙醇。

在烹制菜肴过程中,是先放盐还是后放盐,要因菜而异。

  b。盐析,将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,破坏在水溶液中的稳定因素电荷而沉淀。

凡是制作汤菜(如煮肉汤、炖鸡汤等)在制作前都不可先放盐,以免蛋白质迅速变性凝固,在肉表面形成一层保护层,原料的鲜味得不到析出,汤汁的味道不尽鲜美;若是制作卤菜等,则必须在制作汤卤时先将盐放入,目的就是尽量减少原料蛋白质的渗出,让原料的鲜味保留其中;烧鱼时,先用盐码味,使鱼体表面的水分渗出,加热时蛋白质变性的速度就会加快,且鱼不易碎,也有利于咸味的渗透。

  3、蛋白质变性:在某些物理和化学因素作用下,其特定的空间构象被破坏,从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。主要为二硫键和非共价键的破坏,不涉及一级结构的改变。变性后,其溶解度降低,粘度增加,结晶能力消失,生物活性丧失,易被蛋白酶水解。常见的导致变性的因素有:加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂、超声波、紫外线、震荡等。

图片 1

  4、蛋白质的紫外吸收:由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸,因此在280nm处有特征性吸收峰,可用蛋白质定量测定。

图片 2

  5、蛋白质的呈色反应

图片 3

  a。茚三酮反应:经水解后产生的氨基酸可发生此反应,详见二、3

  b。双缩脲反应:蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸酮共热,呈现紫色或红色。氨基酸不出现此反应。蛋白质水解加强,氨基酸浓度升高,双缩脲呈色深度下降,可检测蛋白质水解程度。

  七、蛋白质的分离和纯化

  1、沉淀,见六、2

  2、电泳:蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的,在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同,有薄膜电泳、凝胶电泳等。

  3、透析:利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

  4、层析:a。离子交换层析,利用蛋白质的两性游离性质,在某一特定PH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析,含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。b。分子筛,又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内,滞留时间长,大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。

  5、超速离心:既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

  八、多肽链中氨基酸序列分析

  a。分析纯化蛋白质的氨基酸残基组成

  (蛋白质水解为个别氨基酸,测各氨基酸的量及在蛋白质中的百分组成),测定肽链头、尾的氨基酸残基二硝基氟苯法(DNP法),头端,尾端羧肽酶A、B、C法等,丹酰氯法

  ↓

  水解肽链,分别分析

  胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)法:水解芳香族氨基酸的羧基侧肽键

  胰蛋白酶法:水解赖氨酸、精氨酸的羧基侧肽键

  溴化脯法:水解蛋氨酸羧基侧的肽键

  ↓

  Edman降解法测定各肽段的氨基酸顺序

  (氨基末端氨基酸的游离α-氨基与异硫氰酸苯酯反应形成衍生物,用层析法鉴定氨基酸种类)

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